Редактирование гена для чайников: как открытие Дженнифер Дудны и Эмманюэль Шарпантье изменило биологию и принесло им Нобелевскую премию
Присуждение Нобелевской премии за изобретение технологии редактирования геномов Дженнифер Дудне и Эмманюэль Шарпантье было лишь вопросом времени — трудно найти за последние два десятилетия пример технологии, которая в большей степени революционизировала науки о жизни. При этом следует понимать, что технологии направленного изменения геномов живых организмов существовали и раньше: научная дисциплина «генная инженерия» насчитывает минимум полувековую историю. Однако ранние техники требовали больших усилий и времени, а успех не всегда был гарантирован. Поэтому то, что сделали Дженнифер и Эмманюэль, действительно стало этапным моментом.
В 2012 году они обнаружили неожиданное применение системы бактериального иммунитета — молекулярного механизма, с помощью которого бактерии обнаруживают внутри себя геном паразита — бактериального вируса — и обезвреживают его. Дудна и Шарпантье показали, что с помощью этого механизма можно разрезать в наперед заданной точке любую молекулу ДНК, и не только бактериальной, а любого организма. Дальнейшее оказалось делом техники: если вы можете «раскусить» с помощью белка-фермента определенную последовательность ДНК, клетки станут залечивать этот разрыв, а в процессе залечивания можно внести в гены нужные вам изменения.
Демонстрация того факта, что эти «ножницы», используемые бактерией для борьбы с вирусами, вынуть из бактерии и использовать в пробирке или в клетках высших организмов для направленного изменения любой последовательности ДНК, открыло эру геномного редактирования нового типа — иногда его называют «редактированием для чайников». Возникли разговоры о том, что теперь биохакеры могут делать это «в гаражах», как в 70-е годы основоположники компьютерной революции создавали первые персональные компьютеры и продукты для них. На самом деле это, конечно, далеко не так просто. Тем не менее, открылось огромное поле возможностей для самых разных ученых, изучающих и бактерии, и растения, и животных, и людей. Вдруг стало возможным адресно изменять интересующие места генома и смотреть, что из этого получится.
Наверное, самый известный публике пример — это сомнительные опыты китайского генетика Хэ Цзянькуя по редактированию генома девочек-близнецов. Кстати, против этой работы очень резко выступила одна из сегодняшних нобелиаток, Дженнифер Дудна. Однако из технологии редактирования выросло огромное множество практических приложений. К примеру, сейчас в стадии клинических испытаний находятся методики, использующие геномное редактирование для лечения некоторых форм рака легких, болезней типа мышечной дистрофии Дюшенна, проблем, связанных со старческой дегенерацией сетчатки, а также многих лейкемий.
Что касается немедицинских применений, то многие из них уже реализованы на коммерческой основе. Получен целый ряд сельскохозяйственных животных и растений, обладающих заданными свойствами. Вот несколько анекдотичный пример: как известно, в магазинах шампиньоны на срезах быстро темнеют. С точки зрения продавца, это плохо, потому что покупатели не хотят покупать черные шампиньоны, а хотят белые. Выяснилось, что ген, который кодирует белок, ответственный за потемнение, можно разрушить, используя технологию CRISPR-cas. И вот в США пару лет назад были одобрены к использованию шампиньоны с отредактированным геном. Теперь потребитель может покупать старые шампиньоны по цене свежих. И это прекрасно, — это и доказывает, что наука очень полезная вещь.
Если же говорить серьезно, то сегодня, по моим оценкам, объем рынка технологий, основанных на CRISPR-cas, составляет около $2 млрд. По другим оценкам , к 2027 году он достигнет $10 млрд.
К сожалению, сегодняшнюю нобелевскую премию омрачает одна не очень красивая история. Мой друг и коллега Виргиниюс Шикшнис из Вилнюсского университета сделал научную работу , которая по существу предвосхищала результаты Дудны и Шарпантье. Написанная им статья была представлена к публикации раньше, чем работы Шарпантье и Дудны, однако прошла много мытарств, а в результате была опубликована позже, и не в престижном Nature, а в чуть менее респектабельном PNAS. Формальный приоритет Шикшниса признает большинство научного сообщества, и он даже удостоился за свою работу премии Калви — норвежского аналога Нобелевки. Таким образом, Литва как государство никогда не была так близка к тому, чтобы гордиться собственным нобелевским лауреатом, как сегодня. К сожалению, этого не произошло.
Следует упомянуть и еще одно имя — Фэна Чжана из Института Брода (MIT). Буквально через полгода после выхода работы Дудны он сделал следующий шаг, показав, что методику можно применять не только в пробирке, но и в живых клетках человека. В патентном споре с первооткрывателями метода Чжан одержал ряд побед . Однако с точки зрения фундаментальной науки это все же второй шаг: сперва надо было показать, что такое в принципе возможно, что и сделали нобелиаты. При этом, конечно, работе Чжана тоже нельзя не отдать должное.
Что ж, у любого открытия всегда есть много родителей. Это не умаляет того факта, что Дженнифер и Эмманюэль сделали огромное дело, положив начало огромной области биологических и медицинских исследований. Воспользуюсь этой колонкой, чтобы передать им мои поздравления.
Мнение автора может не совпадать с точкой зрения редакции
Бизнес на молекулах: 6 стартапов, зарабатывающих на генетических исследованиях
Бизнес на молекулах: 6 стартапов, зарабатывающих на генетических исследованиях
Генетические тесты, которые позволяют подобрать фитнес-программу или узнать о творческих способностях ребенка, за пять лет в превратились из наукоемкого продукта в массовый сервис. Скрининги на основе таких тестов предлагают около десятка специализированных компаний, а услуги по расшифровке структуры ДНК появились в популярных сетях лабораторий.
Компания «Генотек», которая первой взялась за популяризацию генетических исследований в 2010 году, 9 февраля 2016 года получила в ходе очередного раунда финансирования $2 млн от группы инвесторов во главе с генеральным директором и совладельцем «Русагро» Максимом Басовым и бывшим руководителем администрации президента России Александром Волошиным. Это второй крупный раунд для стартапа – в конце 2013 года он получил $500 000 от фонда RuStarsVentures.
Какие еще российские компании, работающие в сфере генетических исследований, привлекают к себе внимание инвесторов?
«Генотек», основанная выпускниками МГУ Артемом Елмуратовым и Валерием Ильинским, делает ставку на максимально широкую линейку тестов для обычных пользователей. Примерно за 15 000 рублей можно получить тест о наследственных предрасположенностях к той или иной группе болезней или тест для подбора персональных тренировки и диеты. Каждое новое исследование компания продает почти за 5000 рублей. Базовый комплексный тест, самый популярный, обойдется в 15 000 рублей, полная расшифровка генома – в 425 000 рублей. Средний чек покупателя превышает 20 000 рублей. За 2015 год «Генотек» удвоила количество тестов, говорит Елмуратов. В рублевом выражении выручка проекта за два года выросла в 2-3 раза, но в долларовом эквиваленте оказалась меньше ожидавшихся $2 млн из-за скачков валютного курса, поясняет предприниматель.
Около половины доходов «Генотеку» приносят исследования для научных лабораторий – например, компания изучала новые штаммы микроорганизмов, в частности туберкулеза, а также геном десятков онкологических пациентов, с анализом их опухолей и здоровых клеток. Обращаются в «Генотек» и археологи – для ДНК-анализа найденных останков. Средняя стоимость таких исследований – сотни тысяч рублей. Создатели проекта экспериментируют и сами – например, разрабатывают методы генотипирования для определения породы собак, но пока не встретили энтузиазма у заводчиков.
Половину полученных инвестиций компания потратит на оборудование роботизированной лаборатории в районе метро «Курская» в Москве. Она откроется в ближайшие месяцы, обещают создатели «Генотека». Во-первых, многие операции (например, выделение ДНК из слюны, клонирование и первичное тестирование фрагмента цепочки нуклеотидов) можно передать из рук человека роботу, во-вторых – в лаборатории будут прозрачные стены, так что новый медико-генетический центр станет и инструментом маркетинга. Остальная часть средств пойдет на расширение штата ученых, запуск новых тестов и продвижение услуг.
Российский рынок ДНК-тестов Елмуратов оценивает в $10-20 млн, в ближайшие годы он вырастет до $100 млн, считают основатели «Генотека». По итогам 2016 года компания рассчитывает заработать $2 млн, около четверти этой суммы может обеспечить экспорт – стартап планирует проводить исследования в сфере биоинформатики (от сборки генома до специфических задач по анализу данных) на 20-30% дешевле, чем американские и европейские конкуренты. «Продавать в долларах, оплачивая труд российских специалистов в рублях, – хорошая стратегия для российского стартапа», – признает Елмуратов.
Компания «Геноаналитика» смогла выделиться на фоне конкурентов, первой в России предложив наряду с другими генетическими тестами определение заболеваний плода по крови матери. Несколько лет назад в возможности таких исследований вообще сомневались – ученые вели споры о том, есть ли внеклеточные ДНК малыша в крови беременной. Поэтому когда в 2011 году Егор Прохорчук (на фото), сооснователь «Геноаналитики», прочитал в одном из научных журналов о начале клинических испытаний неинвазивного пренатального тестирования, он загорелся идеей для бизнеса.
На тот момент компания, основанная учеными из разных российских институтов в сфере молекулярной биологии, больше двух лет продавала услуги по расшифровке и интерпретации генома на основе анализа микроматрицы. Это были те самые тесты, которые позволяют по нескольким каплям слюны диагностировать носительство мутаций, распространенных моногенных заболеваний, как и у американского первопроходца 23andMe. «Геноаналитика» была первой в России, кто предложил эту услугу массовому рынку.
Затем Прохорчук понял: скрининг, позволяющий определить синдром Дауна и других заболеваний, связанных с отклонениями в числе хромосом в ДНК плода, станет «горячей» темой, и подключил ученых для разработки собственной технологии. Обычно для диагностики хромосомных аномалий у будущего новорожденного нужен забор околоплодных вод, с проколом плодного пузыря, что повышает риск выкидыша. Поэтому куда безопаснее использовать генетический метод, по крови из вены. Исследование по методике «Моего гена» уже прошли более 3000 женщин. Они часто заказывают и тесты по анализу генетических причин выкидышей, мертворождения или бесплодия – с этими исследованиями «Геноаналитика» также стала первопроходцем. Результаты ДНК-тестов дополняют УЗИ, биохимические анализы и другие исследования беременных женщин и плода, так что обычно пациентки приходят по направлению от врачей из клиник. Клиенты же услуг персонального генетического тестирования, как правило, определяют важность технологий сами.
Сегодня в линейке «Геноаналитики» – пять групп пакетов исследований, от исследования для подбора лекарств до тестов на выявление предрасположенности к полигенным заболеваниям вроде рака молочной железы. В каждом из тестов – анализ нескольких десятков показателей. Комплексный базовый тест обойдется в 30 000 рублей. В собственные технологии ДНК-диагностики и оборудование лабораторий основатели «Геноаналитики» инвестировали около $5 млн. «Зато мы смело можем говорить, что тесты на предрасположенность более чем к 50 заболеваниям, передающимся по наследству, делаются полностью в России и по своей системе анализа ДНК», – говорит гендиректор компании Юлия Ахтительнова.
Выручка «Геноаналитики» по итогам 2015 года составила около $1,1 млн, бизнес вышел в прибыль еще в 2012 году. Около половины доходов приносят анализы для врачей и научных лабораторий, затрудняющихся в постановке диагноза в сложных случаях генетической диагностики. Когда обнаруживаются нетипичные пропуски и ошибки в последовательностях нуклеотидов, сверить замены в геноме конкретного человека с созданной базой опасных модификаций сложно.
В 2016 году «Геноаналитика» рассчитывает увеличить выручку как минимум в полтора раза. «Конечно, медицина – консервативная и скованная стандартами отрасль, продвигать здесь услуги нелегко. Наши тесты недешевые, а снизить цены не получается из-за кризиса, так что технологии входят в жизнь не так активно, как бы нам хотелось. Нужно, чтобы такие методы появлялись в стандартах диагностики Минздрава, тогда более точный и безопасный скрининг станет массовым», – подытоживает Ахтительнова.
Компания Oftalmic нашла свою нишу на рынке – она продает тесты «под ключ» для диагностики офтальмологических заболеваний. Создатель проекта Марианна Иванова, офтальмолог с большой клинической практикой, еще в 2008 году замечала, что и к ней, и к коллегам часто обращаются пациенты с глазными болезнями, связанными с наследственностью. Диагностировать различные виды дистрофий сетчатки, глаукому или катаракту наряду с еще несколькими десятками заболеваний исключительно в сфере офтальмологии по общему генетическому тесту с высокой точностью сложно – нужны более сфокусированные тесты, которые проводились лишь в двух лабораториях, в Москве и Санкт-Петербурге. Иванова знала, что «с улицы» и даже по назначению врача всех желающих в этих лабораториях не проверят. Так и возникла Oftalmic, сегодня предлагающая около 60 тестов только в сфере глазной ДНК-диагностики. Цены варьируются от 12 000 до 130 000 рублей. При этом Oftalmic, проанализировав клиническую картину, проводит не только подбор теста, а затем и ДНК-тестирование, но и консультацию, дает рекомендации по экспериментальному лечению.
Клиенты Oftalmic приходят по совету врачей – дифференциальные тесты обычно неизвестны широкой публике, об их необходимости рассказывают профессионалы. Так что продвигается бренд за счет «сарафанного радио» среди врачей и сотрудников лабораторий. Также Oftalmic сотрудничает с другими компаниями на рынке ДНК-диагностики. Так, тесты в сфере офтальмогенетики биомедицинского холдинга «Атлас», одного из самых известных поставщиков генетических тестов, созданы при участии проекта Ивановой. По словам основательницы Oftalmic, за глазными генетическими тестами обращаются «десятки» пациентов ежемесячно. По данным СПАРК, Oftalmic зарабатывает ежегодно лишь несколько сотен тысяч рублей, но для Ивановой искать изменения в геноме, приводящие к заболеваниям глаз, и разъяснять результаты генетических тестов – еще и важная социальная миссия.
Офис компании «Унипро», возникшей еще в начале 1990-х, расположен в центре Новосибирского академгородка – студенты, которые приходят на стажировку и работу, могут добежать в лекционную аудиторию за 15-20 минут, а чтобы попасть на встречу с пользователями из трех известных биомедицинских институтов (Институт цитологии и генетики, Институт химической биологии и фундаментальной медицины и Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН), сотрудникам нужно пройти несколько сотен метров.
«Унипро» десятилетиями была одним из основных разработчиков практически всех программных решений Java-платформы (системы тестирования, компиляторы, библиотеки и др.) для Sun Microsystems. Одновременно уже восемь лет компания распространяет свободное программное обеспечение UGENE, которое служит универсальной биоинформатической средой для работы с данными для молекулярных биологов по всему миру. Софи UGENE можно скачать бесплатно для платформ Windows, Linux или Mac и работать с данными секвенирования генома, «собирать» последовательности из кусочков нуклеотидов или аминокислот, визуализировать процессы в РНК и ДНК и т.д. Также UGENE позволяет анализировать белки (работать с аминокислотными последовательностями, наглядно представлять 3D-структуры белков и др.).
Ежегодное число уникальных пользователей UGENE превышает 14 000, еженедельно ее запускают более 1000 специалистов (и это только по данным добровольной статистики, на которую дают согласие не все). Около 20% пользователей – из США, 9% – из России, остальные разбросаны по разным странам мира.
«Мы пытались продавать первые программные продукты в области биоинформатики, но продажи не шли, – говорит Юлия Данилова, заместитель директора по маркетингу «Унипро». – Распространяя софт по свободной лицензии, мы можем построить более крепкий бренд, а те, кого мы учим на семинарах, рано или поздно или могут стать коммерческими заказчиками, или приведут их к нам».
Сейчас у создателей UGENE есть несколько вариантов заработка. Некоторые лаборатории или образовательные организации покупают коммерческую лицензию за 40 000 рублей в год, получая от команды проекта консультации, быстрое исправление дефектов и т. д. Программисты UGENE также берутся за создание личной пользовательской версии программы – если заказчик будет готов отдать ее в общее пользование, то час работы обойдется примерно в 1000 рублей в час, если же это разработка исключительно под индивидуальные нужды заказчика – вдвое больше.
Пока у UGENE менее 5% платных пользователей, в ближайшие годы менеджеры «Унипро» хотят увеличить этот показатель до 10%. «Пока у нас в команде нет биологов, однако с нами работают привлеченные эксперты. Есть совместные проекты – это для нас возможность узнать о том, что нужно рынку, поработать в команде с теми, кто разбирается во всех нюансах молекулярной биологии, – говорит Ольга Голосова, продуктовый менеджер UGENE. – Модель open source позволяет быть в плотном контакте с пользователями, а значит – хорошо понимать, как улучшать продукт».
Для гендиректора компании Татьяны Никольской (на фото) «РосГенДиагностика» – уже второй серьезный бизнес. В России и за рубежом ее знают как основателя GeneGo, создавшей линейку программных продуктов в области системной биологии. Софтверные решения от GeneGo, объединенные под брендом MetaCore, были предназначены для экспериментальных дисциплин, требующих анализа огромного количества параметров. Системы MetaCore помогали искать новые мишени для лекарственных препаратов и биомаркеров. Пользователями являлись крупнейшие фармацевтические и биотехнологические компании, а также ведущие мировые университеты. К концу 2000-х объем продаж измерялся десятками миллионов долларов в год, компания не снизила темпы роста выручки даже в кризисные годы. В итоге после десяти лет независимой работы GeneGo была приобретена корпорацией Thomson Reuters, сумма сделки не разглашалась.
В 2011 году Никольская задумала новый проект – создать автоматизированную процедуру генной диагностики и подбора максимально эффективного лечения для онкологических больных. В 2012 году она основала «РосГенДиагностику», к которой в течение нескольких лет присоединились бывшие ключевые сотрудники GeneGo.
Эффективность лекарственной терапии, традиционно назначаемой по принципу «одно лекарство для всех», оценивается в 25-35%. Во всем мире группы ученых ищут уникальные молекулярно-генетические изменения (генные мутации, изменения экспрессии отдельных генов) для разработки новых таргетных противоопухолевых препаратов и биомаркеров, необходимых для их назначения. На сегодняшний день, ">http://www.kantarhealth.com/docs/default-source/datasheets/cancermpact-b... по данным Kantar Health, индивидуальный подбор лекарственной терапии с использованием биомаркеров может быть предложен только 17-20% онкологических больных. При этом существующие тесты зачастую позволяют отвергнуть неэффективную терапию, но не дают возможности подобрать альтернативные решения. Поиск и разработка новых биомаркеров может занимать от 5 до 35 лет.
«Опухоль каждого пациента уникальна, в центре внимания должен быть весь набор молекулярно-генетических изменений», – говорит Татьяна Серебрийская, директор по науке и развитию «РосГенДиагностики» (ранее – директор R&D в GeneGo).
«РосГенДиагностика» разрабатывает продукт, который позволит комплексно анализировать геномный и экспрессионный профиль опухоли (то есть определять изменения и на уровне ДНК, и на уровне РНК), а затем составлять индивидуальный молекулярный «портрет» опухоли и подбирать наиболее эффективные для лечения препараты. Такой подход позволит перестать тратить огромные суммы на неэффективную терапию. В состав разрабатываемого продукта входит набор реактивов для лабораторного анализа и программный продукт, который обеспечивает выполнение сложного анализа.
Пока «РосГенДиагностика» в начале пути, развивает технологию и проводит небольшие пилотные клинические исследования на базе Российского онкологического научного центр имени Н.Н.Блохина. Проект поддерживается фондом «Сколково» и, по словам Серебрийской, получил инвестиций из разных источников на сумму более $500 000.
В ближайшие годы основными потребителями будут фармацевтические и молекулярно-диагностические компании США и Европы, говорит менеджер «РосГенДиагностики». Компания также надеется выйти на российский рынок, несмотря на высокую стоимость анализа. В среднем на исследование одного пациента «РосГенДиагностика» тратит около $3000-5000. Так как большая часть реактивов для исследования – импорт, из-за роста курса доллара в рублевом выражении эта сумма выглядит значительной, признает Серебрийская. Хотя стоимость аналогичных исследований с использованием более простых технологий в Америке не превышает $5000-7000. «Мы надеемся, что несмотря на сложности с закупками таргетных препаратов, подбор лечения на основе характеристик индивидуальных механизмов развития опухоли не останется «на бумаге», – надеется директор по науке и развитию «РосГенДиагностики».
«В последнее десятилетие методы лечения рака ушли далеко вперед – химиотерапия действительно эффективно борется с раковыми клетками, дает высокий уровень ремиссии, – говорит Андрей Гаража, директор по развитию проекта OncoFinder. – Проблема в том, что нужно понять, какая опухоль у больного и какой именно препарат будет самым действенным. Пока это не научились делать хорошо, около 70% пациентов умирают из-за неоптимального подбора химиотерапии. Генетические анализы могут сделать его персональным, это увеличит эффективность лечения в разы и десятки раз».
OncoFinder тоже решил «спуститься» в исследованиях глубже простого анализа ДНК и исследовать нарушения в отдельных генах на уровне РНК и поведения белков. Основатели OncoFinder Антон Буздин, Николай Борисов и Алекс Жаворонков создали систему, которая анализирует более 1200 сигнальных путей, из которых около 200 в той или иной степени указывают на развитие рака. Для этого необходим анализ поведения более 10 000 белков-маркеров. Сопоставив то, как происходит активация сигнальных путей в здоровой и пораженной раком клетках, исследователи фиксируют аномалии, возникшие в раковой опухоли на молекулярном уровне. Эта статистика соотносится примерно с 250 зарегистрированными препаратами – и OncoFinder выдает список оптимальных вариантов лечения.
Буздин, Борисов и Гаража, выходцы из Института биоорганической химии РАН, зарегистрировали компанию еще в 2012 году, а затем продолжали исследования с коллегами из других институтов РАН, из МФТИ и ФМБА. В 2013 году они зарегистрировали компанию в Гонконге. С того момента OncoFinder получила от частных инвесторов более $1 млн, уверяют предприниматели. Сегодня стартап, по уверению его создателей, продает диагностические тесты по подбору оптимальной химиотерапии почти 15 российским клиникам и более чем 10 лабораториям в Германии, Швейцарии, США, Канаде и других странах. Два знакомых с финансами компании источника Forbes подчеркивают, что речь идет лишь о нескольких постоянных заказчиках.
Одни клиенты отправляют образцы в лаборатории, с которыми сотрудничает OncoFinder, и получают пакет рекомендаций с обоснованием выбора. Другие, с собственными мощностями исследований, покупают только доступ к облачному сервису OncoFinder, чтобы сотрудники их геномного центра и онкологи могли персонализировать терапию на основе своих исследований. В первом случае компания платит около 60 000 рублей за тест под ключ (в Европе цена составит около $3500), во втором – в 1,5-2 раза меньше. В России OncoFinder продает тесты и сервис с наценкой около 20%, а иногда и вовсе по себестоимости, за рубежом маржинальность продаж достигает 80%, говорят создатели проекта.
«На всех рынках генетическая диагностика рака сводится к поиску типичных мутаций, хотя на самом деле универсального индикатора рака нет, все гораздо сложнее, – говорит Гаража. – И при этом ведется подбор только десятка препаратов. В России – то же самое. А ведь государство, которое берет на себя расходы на химиотерапию и тратит по 2-3 млн рублей на курс, должно быть озабочено тщательной диагностикой и максимально точным подбором препарата. Увы, пока в эту сторону смотрят мало».
Методика OncoFinder не была широко опробована в клинической практике, и в этом риски для стартапа, считает Юрий Кукушкин, сооснователь компании Future Biotech и ранее инвестиционный менеджер венчурного фонда RusBio Ventures. "Классический подход - сначала разработать диагностический подход, потом доказать его действенность (валидировать), а затем - идти "в клинику", - комментирует Кукушкин. - Некоторые стартапы выбирают более агрессивный подход - когда на рынок выходишь быстрее и "дорабатываешь" продукт уже на рынке. В этом есть смысл - если предприниматели считают, что метод может помочь пациенту, то они стараются пойти кратчайшим путем, но нужно отдавать отчет, что соответствие требованиям регуляторов для биотех-стартапа крайне важно"
Тем не менее OncoFinder, по словам его основателей, есть чем похвастаться. За 2015 год компания, по оценкам опрошенных Forbes инвесторов, заработала более $150 000 (сами основатели говорят о годовой выручке в $400 000). Проект ведет переговоры о новом раунде инвестиций для более активного выхода на рынки США и Европы, говорит Гаража. Также деньги нужны на исследования для персонализации химиотерапии в случаях отдельных видов рака – для распространенного рака молочной железы, приводит пример предприниматель, есть 20-25 эффективных протоколов лечения, но на практике в сценарий включают лишь 5-6 – остальные кажутся неподходящими или «лишними».
